● 常識要點和教授教養請求

1)、懂得滅菌的道理和辦法

2)、懂得造就基的滅菌

3)、控制幹冷滅菌道理和影響滅菌的身分

4)、控制間歇滅菌

5)、控制持續滅菌

● 才能造就請求

經由過程本章節的進修，先生能控制造就基滅菌的道理和辦法及其影響滅菌的身分。

● 教案內容

因為雜菌的凈化，使生物反響中的基質或産物因雜菌的消費而喪失，形成臨盆才能的降低;

因為雜菌所發生的一些代謝産物，或在染菌後轉變了造就液的某些理化性質，使産物 的提取和分別變得艱苦，形成收率下降或使産品的質量降低;

雜菌會大批滋生，會轉變反響介質的PH值，從而使生物反響產生異常變更;

雜菌能夠會分化産物，從而使臨盆進程掉敗;

產生噬菌體凈化，微生物細胞被裂解，而使臨盆掉敗，等等。

5.1 滅菌的道理和辦法

滅菌是指應用物理或化學法殺或除去物料及設備中一切有性命物資的進程。經常使用的滅菌辦法大致有以下幾種：

1. 化學試劑滅菌法

經常使用的化學試劑有甲醛、氯氣(或次氯酸鈉)、高錳酸鉀、環氧乙烷等。

2. 電磁波、射線滅菌法

電磁波、紫外線或放射性物資

3. 幹熱滅菌法

幹熱滅菌前提爲在160℃下保溫1h。

4. 幹冷滅菌法

應用飽和蒸汽停止滅菌的辦法稱爲幹冷滅菌法。因為蒸汽具有很強的穿透才能，並且在冷凝時會放出大批的冷凝熱，很輕易使卵白質凝結而殺逝世各類微生物。從滅菌的後果來看，幹熱滅菌不如幹冷滅菌有用，溫度降低10℃時，滅菌速度常數僅增長2-3倍，而幹冷滅菌對耐熱芽孢的滅菌速度常數增長的倍數可到達8-10倍，對養分細胞則更高。同時，蒸汽的起源便利，價錢昂貴，滅菌後果靠得住，是今朝最爲根本的滅菌辦法。普通的幹冷滅菌前提爲：121℃，30min。

5. 過濾除菌法

應用過濾辦法制備無菌空氣。

6. 火焰滅菌法

僅實用于接種針、玻璃棒、三角瓶口等的滅菌。

5. 2造就基的滅菌

但低溫固然能殺逝世造就基中的雜菌，同時也會損壞造就基中的養分成份，乃至會發生晦氣于菌體發展的物資。是以，在工業造就過程當中，除盡量殺逝世造就基中的雜菌外，還要盡量削減造就基中養分成份的喪失，最經常使用的滅菌前提是120℃，20-30min。

權衡熱滅菌的目標許多，最經常使用的是“熱逝世時光”，即在劃定溫度下殺逝世必定比例的微生物所須要的時光。殺逝世微生物的極限溫度稱爲致逝世溫度，在此溫度下，殺逝世全體微生物所須要的時光稱爲致逝世時光。在致逝世溫度以下，溫度越高，致逝世時光就越短。一些細菌芽孢菌等微生物細胞和胞子，對熱的抵禦力分歧，是以它們的致逝世溫度和時光也有差異，見表5-3和表5-4。微生物對熱的抵禦力經常使用“熱阻”表現。熱阻是指微生物在某一特定前提(重要是溫度和加熱方法)下的致逝世時光。絕對熱阻是指微生物在某一特定前提下的致逝世時光與另外壹微生物在雷同前提下的致逝世時光的比值。表5-5列出了某些微生物的絕對熱阻。

表5-5某些微生物的絕對熱阻及其對一些滅菌劑的絕對抵禦力(大腸杆菌比擬較)

滅菌方法大腸杆菌黴菌胞子細菌芽孢嗜菌體或病毒

幹熱滅菌1 2-10 1000 1

幹冷滅菌1 2-10 3×1051-5

苯酚1 1-2 1×10930

甲醛1 2-10 250 2

紫外線1 5-100 2-5 5-10

由表5-5可知，芽孢或胞子的熱阻要比發展期養分細胞的熱阻大很多，這是因為芽孢或胞子內吡啶二羧酸含量對熱阻的增長有關。別的，芽胞子中卵白質含水量較養分細胞低(特殊是遊離水份少)，也是芽孢耐熱強的一個緣由。圖5-2和圖5-3分離爲大腸杆菌養分細胞和FS7954芽孢杆菌的芽孢在分歧溫度下的滅亡情形。

5.3幹冷滅菌道理和影響滅菌的身分

在發酵工業中，對造就基和發酵設備的滅菌，普遍應用幹冷滅菌法。工場裏，蒸汽比擬輕易取得，掌握操作前提便利，是一種簡略而又價廉、有用的滅菌辦法。用幹冷滅菌的辦法處置造就基，其加熱溫度和受熱時光與來菌水平和養分成份的損壞都有關系。養分成份的贍養將影響菌種的造就和産物的生成，所以滅菌水平和養分成份的損壞成爲滅菌任務中的重要抵觸，適當控制加熱溫度和受熱時光是滅菌任務的癥結。

5.3.1滅菌動力學

1. 微生物的滅亡速度

1)對數殘留定律

微生物受熱滅亡的緣由，重要是因低溫使微生物體內的一些主要卵白質，如酶等，產生凝結、變性，從而招致微生物沒法生計而滅亡。微生物受熱而損失活氣，但其物感性質不變。在必定溫度下，微生物的受熱滅亡遵守份子反響速度實際。在滅菌過程當中，活菌數逐步削減，其削減量隨殘留活菌數的削減而遞加，即微生物的滅亡速度與任一瞬時殘余的活菌數成反比，如圖5-2所示，大腸杆菌的滅亡曲線爲線性關系，稱之爲對數殘留定律，也即反應爲一級化學反響動力學爲：

-dN/dt=KN

式中，N—殘余的活菌數;t—滅菌時光(s);K—滅菌速度常數(s-1)，與稱反響速度常數或比滅亡速度常數，此常數的巨細與微生物的品種與加熱溫度有關;dN/dt—活菌數瞬時變更速度，即滅亡速度。

上式經由過程積分可得：Nt/N0=e-kt

t=1/KlnN0/Nt=2.303/KlgN0/Nt

式中：N0—開端滅菌(t=0)時原有活菌數;Nt=經時光t後殘余活菌數。

上式是盤算滅菌的根本公式，滅菌速度常數K是斷定微生物受熱滅亡難易水平的根本根據。各類微生物在異樣的溫度下K值是分歧的，K值愈小，則此微生物愈耐熱。

即便關於統壹微生物，也受微生物的心理狀況、發展前提及滅菌辦法等多種身分的影響，其養分細胞和芽孢的比滅亡速度也有極大的差別，就微生物的熱阻來講，細菌芽孢是比擬耐熱的，胞子的熱阻要比發展期細胞大很多。例如，在121℃時，枯草杆菌FS5230的K爲0.47-0.063s-1，梭狀芽孢杆菌PA3679的K爲0.03s-1，嗜熱芽孢杆菌FS1518的K爲0.013s-1，熱芽孢杆菌FS617的K爲0.048s-1。

從上述的微生物對數滅亡紀律和非對數滅亡動力學模子方程式可知，假如要到達完全滅菌，即滅菌停止時殘留的活微生物數等于0，則滅菌所需的時光應爲無窮長，這在現實中是弗成能的。是以，工程上，在停止滅菌的設計時，常以為N/N0=0.001，即在1000次滅菌中，許可有一次掉敗。

5.3.2滅菌的溫度和時光

微生物的受熱滅亡屬于單份子反響，其滅菌速度常數K與溫度之間的關系可用阿累尼烏斯公式表現：

K=Aexp(-ΔE/RT) (5.8)

或 lnK=lnA--ΔE/RT (5.9)

式中：A---頻率常數，也稱阿累尼烏斯常數，s-1;R---氣體常數，8.314J/mol·K;T---相對溫度，K;ΔE---微生物滅亡活化能，J/mol。

因而可知，ΔE/R是微生物受熱滅亡時對溫度敏理性的器量，此值越大，註解微生物滅亡速度隨溫度的變更越敏感;反之，就越不敏感，是以，在滅菌操作中，ΔE/R是一個非常主要的參數。

當造就基被加熱滅菌時，常會湧現如許的抵觸，這就是，加熱時，微生物雖然會被殺逝世，但造就基中的有效成份也會隨之遭到損壞，那末有何良策可以既到達滅菌請求，同時又不損壞或盡量少損壞造就基中的有效成份呢?

理論證實，在高壓加熱的情形下，造就基中的氨基酸和維生素極易被損壞，如在121℃，僅20min，就有59%的賴氨酸和精氨酸及其他堿性氨基酸被損壞，蛋氨酸和色氨酸也有相當數目被損壞。是以，必需選擇一個既能知足滅菌須要，又可以使造就基的損壞盡量贍養的滅菌工藝前提。

因為滅菌時殺逝世微生物的活化能大于造就基成份的損壞活化能值，是以：

即隨著溫度的上升，微生物的滅亡速度常數增長倍數要大于造就基成份的損壞速度的增長倍數。也就是說，當滅菌溫度上升時，微生物殺逝世速度的進步要跨越造就基成份的損壞速度的增長。

從上述的剖析可知，在熱滅菌過程當中，同時會產生微生物滅亡和造就基損壞這兩種進程，且這兩種進程的停止速度都隨溫度的降低而加快，但微生物的滅亡速度隨溫度的降低更加明顯。是以，可選擇適合的滅菌溫度和時光來折衷兩者之間的抵觸。

一個事例爲，滅菌要到達殺逝世99.99%的細菌芽孢，有兩種辦法可以采取，一種是118滅菌15min，另外壹種是128滅菌5min。而造就基中B族維生素的保存值在前一種方法爲90%，後一種方法爲95%。因而可知，在低溫下滅菌，時光是一個異常主要的身分，圖5-6和表5-8分離表現殺逝世細菌芽孢與保存B族維生素的時光與溫度關系和在不下降劃定的滅菌條件下()，滅菌溫度、時光和養分成份損壞量的關系。

表5-8滅菌溫度、時光與養分成份損壞量的關系()

滅菌溫度滅菌時光(分)養分成份損壞量%

100 400 99.3

110 36 67.0

115 15 50.0

120 4 27.0

130 0.5 8.0

145 0.08 2.0

150 0.01 1.0

因而可知，若要削減養分成份的損壞，可降低溫度滅菌。

據此，可以在滅菌時選擇較高的溫度、較短的時光，如許便既可到達須要的滅菌水平，同時又可削減養分物資的喪失。

5.3.3影響滅菌的身分

1) 造就基成份

固體造就基的滅菌時光要比液體造就基的滅菌時光長。

2) 造就基的物理狀況

造就基的PH值愈低，滅菌所需的時光就愈短。

3) 造就基的PH值

4) 造就基中的微生物數目

是以，在現實臨盆中，不宜采取嚴重黴腐的原料和腐爛的水質，由於這類原估中不只有用成份少，並且微生物數目中，完全滅菌比擬艱苦。

5) 微生物細胞中水含量

6) 微生物細胞菌齡

年青細胞輕易被殺逝世。

7) 微生物的耐熱性

各類微生物對熱的抵禦力是分歧的，細菌的養分體、酵母、黴菌的菌絲體對熱較爲敏感，而放線菌、酵母、黴菌胞子比養分細胞的抗熱性要強，細菌芽孢的抗熱性就更強。普通講，無芽孢的細菌或黴菌胞子在100以下加熱3-5min都可被殺逝世，然則有些細菌芽孢的熱阻較大，100、30min仍未被殺逝世，所以滅菌的完全與否應以殺逝世細菌孢爲尺度。

8) 空氣消除情形

蒸汽滅菌過程當中，溫度的掌握是經由過程掌握罐內的蒸汽壓力來完成。壓力表顯示的壓力應與罐內蒸汽壓力絕對應，即壓力表的壓力所對應的溫度應是罐內的現實溫度。然則假如罐內空氣消除不完整，壓力表所顯示的壓力就不單是罐內蒸汽壓力，還包含了空氣分壓，是以，此時罐內的現實溫度就低于壓力表顯示壓力所對應的溫度，鳳致形成滅菌溫度不敷而滅菌不完全，如表5-12所示。

表5-12蒸汽壓力與溫度的關系

蒸汽壓力(atm) 響應的溫度(℃)空氣完整驅除水平罐內現實溫度(℃)

0.3 107.7 完整驅除121.6

0.7 115.5 驅除非/3 115.0

1.0 121.6 驅除此以外/2 112.0

1.3 126.6 驅除此以外/3 109.0

1.5 130.5 全未驅除100.0

9) 攪拌

10) 泡沫

5.4間歇滅菌

5.4. 1間歇滅菌

造就基的間歇滅菌就是將配制好的造就基放在發酵罐或其他裝配中，通入蒸汽將造就基和所用設備壹路停止加熱滅菌的進程，平日也稱爲實罐滅菌。

間歇滅菌進程包含升溫、保平和冷卻等三個階段，圖5-7爲造就基間歇滅菌過程當中的溫度變更情形。

5.4.2間歇滅菌的盤算

嚴厲地講在升溫階段的前期和冷卻階段的後期，造就基的溫度很高，因此具有必定的滅菌感化。

因而可知，滅菌過程當中加熱和保溫階段的滅菌感化是重要的，而冷卻階段的滅菌感化是主要的，普通很小，可以疏忽不計。另外，還應指出的是，應該防止太長時光的加熱階段，由於加熱時光太長，不只會損壞養分物資，並且也有能夠惹起造就液中某些無害物資的生成，從而影響造就進程的順遂停止。

在現實臨盆中，也能夠碰到所供蒸汽缺乏、溫度不敷高的情形，這時候可以恰當延伸滅菌

時光。臨盆上乃至有效100蒸煮而到達完全滅菌的實例。如要做固體曲而沒有低溫蒸汽

時，可將原料用100蒸汽蒸30min，殺逝世個中的養分細胞，但胞子與細菌的芽孢沒有被

殺逝世。將蒸過的原料置于室溫下留宿，未被殺逝世的胞子便抽芽發展，芽孢發育成養分細

胞，再蒸30min即可殺逝世。如斯持續重復停止2-3次，亦可到達完全滅菌的目標。

5.4.3間歇滅菌的操作

間歇滅歇是在所用的發酵罐或其他造就裝配中停止的，它是在配制罐中配好造就基後，經由過程公用管道輸出發酵罐等造就設備中，然後開端滅菌。在停止造就基的間歇滅菌之前，平日先將發酵罐等造就裝配的分空氣過濾器停止滅菌，而且用空氣將分過濾器吹幹。開端滅菌時，應先放去夾套或蛇管中的冷水，開啓排氣管閥，經由過程空氣管向發酵罐內的造就基通入蒸汽停止加熱，同時，也可在夾套內通蒸汽停止直接加熱。當造就基溫度升到

70閣下時，從取樣管和放料管向罐內通入蒸汽進一步加熱，當溫度升至120，罐壓爲1*105Pa(表壓)時，翻開接種、補料、消泡劑、酸、堿等管道閥門停止排汽，固然在保溫過程當中，應留意凡在造就基液面下的各類出口管道都應通入蒸汽，而在液面以上的其他各管道則應排放蒸汽，如許能力不留逝世角，從而包管滅菌完全。保溫停止後，順次封閉各排汽、進汽閥門，待罐內壓力低于空氣壓力後，向罐內通入無菌空氣，在夾套或蛇管中通冷水降溫，使造就基的溫度降到所需的溫度，停止下一步的發酵和造就。

因為造就基的間歇滅菌不須要專門的滅菌設備，投資少，對設備請求簡略，對蒸汽的請求也比擬低，且滅菌後果靠得住，是以，間歇滅菌是中小型臨盆工場常常采取的一種造就基滅菌辦法。

5.5持續滅菌

5.5. 1造就基的持續滅菌

造就基的持續滅菌，就是將配制好的造就基在向發酵罐等造就裝配保送的同時停止加熱、保平和冷卻而停止滅菌。圖5-9爲持續滅菌過程當中溫度的變更情形。由圖可以看出，持續滅菌時，造就基可在短時光內加熱到保溫溫度，而且能很快地被冷卻，是以可在比間歇滅菌更高的溫度下停止滅菌，而因為滅菌溫度很高，保溫時光就響應地可以很短，極有益于削減造就基中的養分物資的損壞。

5.5. 2持續滅菌的根本流程

造就基持續滅菌的根本流程如圖5-10所示。持續滅菌的根本設備普通包含(1)配料預熱罐，將配制好的料液預熱到60-70，以免持續滅菌時因為料液與蒸汽溫度相差過大而發生水汽撞擊聲;(2)連消塔，連消塔的感化重要是使低溫蒸汽與料液敏捷接觸混和，並使料液的溫度很快降低到滅菌溫度(126-132);(3)保持罐，連消塔加熱的時光很短，光靠這段時光的滅菌是不敷的，保持罐的感化是使料液在滅菌溫度下堅持5-7min，以到達滅菌的目標;(4)冷卻管，從保持罐出來的料液要經由冷卻排管停止冷卻，臨盆上普通采取冷水噴淋冷卻，冷卻到40-50後，保送到事後曾經滅菌過的罐內。

圖5-11爲放射加熱持續滅菌流程，流程中采取了蒸汽放射器，它使造就液與低溫蒸汽直接接觸，從而在短時光內可將造就液急速升溫至預定的滅菌溫度然後在該溫度下保持一段時光滅菌，滅菌後的造就基經由過程一收縮閥進入真空冷卻器急速冷卻，從圖中可以看出，因為該流程中造就基受熱時光短，養分物資的喪失也就不很嚴重，同時該流程包管了造就基物料先輩先出，防止了過熱或滅菌不完全等景象。

圖5-12爲薄板換熱器持續滅菌流程，流程中采取了薄板換熱器作爲造就液的加熱和冷卻器，蒸汽在薄板換熱器的加熱段使造就液的溫度降低，經保持段保溫必定時光後，造就基在薄板換熱器的冷卻段停止冷卻，從而使造就基的預熱、加熱滅菌及冷卻進程可在統壹設備內完成。該流程的加熱和冷卻時光比放射加熱持續滅菌流程要長些，但因為在造就基的預熱進程同時也起到了滅菌後造就基的冷卻，因此勤儉了蒸汽和冷卻水的用量。

造就基的持續滅菌的長處是滅菌的溫度較高，滅菌時光較短，造就基的養分成份受砉珠水平較低，從而包管了造就基的質量，同時因為持續滅菌進程不在發酵罐等設備中停止，進步了發酵罐等設備的應用率。固然與間歇滅菌進程比擬，持續滅菌進程的缺乏的地方是進程所需的設備較多，操作較爲費事，染菌機遇也響應較多。

造就基采取持續滅菌時，加熱器、保持罐(管)和冷卻器和發酵罐等都應先輩滅菌，然後能力停止造就基的持續滅菌。同時構成造就基的耐熱性物資和不耐熱性物資可在分歧溫度下離開滅菌，以削減物資的受熱損壞水平，也可將碳源與氮源離開滅菌，以避免醛基與氨基產生反響，避免無害物資的生成。

5.6間歇滅菌與持續滅菌的比擬

間歇滅菌或持續滅菌都有各自的長處和缺陷，現比擬以下。

表5-14間歇滅菌與持續滅菌的比擬

由表可見，不管在實際上或許在理論上，與間歇滅菌進程比擬，持續滅菌的長處非常顯著。是以，持續滅菌愈來愈多地被用造就基的滅菌。